獲得高質量的高爾基體(ti) 分離物，對於(yu) 進一步分析和理解這種細胞器至關(guan) 重要。Himac 目前隸屬於(yu) Eppendorf集團，擁有 60 多年定製研發落地式超速離心機的豐(feng) 富經驗。在本應用說明中，我們(men) 將采用一係列差速離心和非連續蔗糖密度梯度離心操作，使用 Himac CP80-NX離心機（搭配 P32ST 和 P40ST 水平轉子）從(cong) 水稻幼苗中分離高爾基體(ti) 。
 

圖 1：搭載 P32ST 和 P40ST 型水平轉子的 CP 係列超速離心機

120 多年前，卡米洛 · 高爾基（Camillo Golgi）首次發現了真核細胞的高爾基體(ti) 。之後，（電子）顯微技術的發展揭示了高爾基體(ti) 的複雜結構，而進一步的生化分析則闡明了細胞內(nei) 這種細胞器的各項功能 [2]。在高等生物細胞中，作為(wei) 分泌途徑的一部分，高爾基體(ti) 負責合成複合多糖體(ti) 、加工蛋白質並將蛋白質分配到其他細胞器中（圖 2）[1]。
 

葉綠體(ti) 蛋白質的轉運機製

(1) 通過TOC-TIC複合體(ti) 的正常轉運途徑
(2) 通過分泌途徑的特殊轉運途徑（ER-高爾基體(ti) ）
圖 2：植物細胞通過以下途徑完成蛋白質轉運：
（1）Toc-Tic複合體(ti) 轉運機製（2）高爾基體(ti) 和分泌途徑
 

α- 澱粉酶就屬於(yu) 此類蛋白質，它是一種負責植物內(nei) 澱粉分子水解的糖苷酶。研究表明，α- 澱粉酶在內(nei) 質網（ER）核糖體(ti) 處合成並在內(nei) 質網內(nei) 腔中糖基化後被輸送到高爾基體(ti) 進行低聚糖改性 [3]。然而，由於(yu) 高爾基體(ti) 與(yu) 內(nei) 質網（ER）等其他膜係統形成了複雜結構 [2]，因此分離這種細胞器的不同部分尤其困難。事實上，高爾基體(ti) 膜的某些部位還經常會(hui) 被液泡等其他相連的膜係統汙染 [2]。因此，在本應用說明中，我們(men) 將使用一係列差速離心和密度梯度離心操作（富集特定膜係統的最成熟技術之一）[2]，從(cong) 水稻幼苗中獲取高爾基體(ti) 膜。用這種技術可以獲取高純度、高質量提取物並用於(yu) 質譜等進一步的下遊分析。下麵我們(men) 將詳細介紹使用 CP80-NX 超速落地式離心機（搭配 P32ST 和P40ST 轉子）分離獲取高質量高爾基體(ti) 的過程。

材料與(yu) 方法
所用材料
CP80NX 超速離心機搭配以下水平轉子：
1. P32ST 型水平轉子，適用於(yu) 40 mL PET 離心管
2. P40ST 型水平轉子，適用於(yu) 13 mL PET 離心管

第 1 步：
使用 P32ST 型水平轉子 （40 mL PET 離心管） 和 P40ST 型水平轉子 （13 mL PET 離心管），完成微粒體(ti) 純化過程。
1. 在 4°C 條件下，使用水平轉子，在 40 mL PET 離心管中以15,000 x g 的速度離心純化水稻提取物 30 分鍾，並移除沉降物。
2. 在 13 mL PET 離心管中，底部鋪墊 1 mL 50% 濃度蔗糖溶液，中間層裝入 1 mL 15% 蔗糖溶液，頂部裝入 11 mL 上清液。15% 蔗糖溶液置於(yu) 1 mL 50% 蔗糖墊層之上，將11 mL 上清液裝入 1 mL 15% 蔗糖溶液頂部。
3. 在 4°C 條件下，以 100,000 × g 的離心力離心 3 小時，然後收集 50% 蔗糖墊層溶液中截留的微粒體(ti) 部分。

第 2 步：
使用 P40ST型水平轉子 （13 mL PET離心管），從(cong) 微粒體(ti) 部分純化高爾基體(ti) 。
1. 使用手持糖量儀(yi) ，利用 60% 蔗糖緩衝(chong) 液將收集的微粒體(ti) 蔗糖溶液密度中和至 42%。在該溶液上層裝入 1-2 mL 其他非連續蔗糖密度梯度，每個(ge) 梯度由 1 mL 濃度為(wei) 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖層組成。隨後，小心地加滿水至13 mL。
2. 4°C，100,000 × g 離心 3 小時，然後迅速收集漂浮在34% 和 38% 蔗糖層之間界麵相的高爾基體(ti) 部分（1）。
3. 再次將收集的高爾基體(ti) 部分中和至蔗糖密度 42%，然後再次裝入 1-2 mL 不連續的蔗糖梯度溶液，每個(ge) 梯度由 1 mL 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖層組成。小心加滿水至13 mL。
4 .4°C， 100,000 × g 離心 3 小時，然後收集漂浮在 34% 和38% 蔗糖層之間界麵相的高爾基體(ti) 部分（2）。

通過使用細長的 13 mL 離心管完成兩(liang) 次浮選離心，即可從(cong) 微粒體(ti) 中分離出高純度的高爾基體(ti) 。回收後的高爾基體(ti) 部分（2）可用於(yu) 實驗和印跡分析。所有蔗糖濃度單位均為(wei) 質量百分比（w/w）。

結果與(yu) 討論

非連續密度梯度離心法是分離或富集亞(ya) 細胞成分的標準方法。在大多數情況下，我們(men) 利用沉降係數或特定密度的差異來獲得分離物。在細胞器的分離應用中，決(jue) 定這些分離參數的主要因素是相應膜的組成成分。獲得高純度的分離物通常比較困難，這一點在與(yu) 其他膜係統緊密相連的高爾基體(ti) [2] 上尤為(wei) 明顯。

因此，高純度的高爾基體(ti) 膜對於(yu) 分析和研究高爾基體(ti) 蛋白質組 [1] 或細胞器內(nei) 特定的蛋白質至關(guan) 重要。

本文使用了兩(liang) 種不同型號的水平轉子，配合一係列非連續蔗糖密度梯度離心步驟，高效可靠地獲得了高質量的高爾基體(ti) 分離物。

在棄掉第一道離心步驟中的細胞碎片後，將上清液裝入第一個(ge) 非連續的蔗糖梯度上（見圖 3）。在 15% 和 50% 的蔗糖相之間為(wei) 富集的微粒體(ti) 部分。隨後，微粒體(ti) 部分通過兩(liang) 次非連續的蔗糖梯度浮選分離步驟而進一步被純化，其中高爾基體(ti) 沉積在梯度為(wei) 34% 和 38% 的蔗糖相之間（圖 3）。Asakura 等人 [4] 的研究表明，經過第二次浮選分離操作後，高爾基體(ti) 部分的純度顯著提高。可以采用免疫印跡法對以下標記酶進行檢測，進而對高爾基體(ti) 的質量進行分析：例如 UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶：細胞質基質）、RbcL（二磷酸核酮糖羧化酶 長鏈：質體(ti) ）、COXII（細胞色素 C 氧化酶亞(ya) 基 2：線粒體(ti) ）和 ARF（腺苷核糖基化因子：高爾基體(ti) ）。

結論

水平轉子 P32ST 和 P40ST 是分離高爾基體(ti) 的理想選擇，兩(liang) 者搭配可以實現從(cong) 40 mL 大容量離心管到 13 mL 小容量離心管的流暢切換，同時保證了優(you) 秀的離心效果。Himac 13 mL PET離心管采用了特殊的細長造型，可實現更長的浮選距離，從(cong) 而提升了高爾基體(ti) 部分的純度。此外，轉子采用的頂部裝載設計，便於(yu) 完成蔗糖梯度處理的精細操作，並且可以將意外混合汙染的風險降至最低。