99cybermondayHitachi超速離心如何助力腫瘤研究99cybermondayhimac離心機官網

腫瘤源的細胞外小囊泡（TEVs, Tumor-derived extracellular vesicles）通過在親(qin) 代細胞和受體(ti) 細胞之間傳(chuan) 遞功能性生物分子，從(cong) 而在癌症的進展過程中發揮關(guan) 鍵作用。

TEVs對於(yu) 其他器官的影響已被不斷報道，這種效果主要是因為(wei) 被包封的生物活性物質，包括脂質體(ti) 、蛋白質、核酸和代謝物。一些研究解釋了TEVs的功能，包括腫瘤發生、轉移生態位的形成和影響免疫平衡。TEVs的分離對研究其生理功能及診斷和治療應用具有重要意義(yi) 。

近期，來自武漢大學的科研人員以小鼠原發性乳腺腫瘤細胞為(wei) 研究對象，提出了一種高效分離TEVs的新方案。這一方案通過差速超速離心法，僅(jin) 用時4小時，就能從(cong) 複雜的腫瘤細胞中提取出高純度的TEVs。這不僅(jin) 為(wei) 深入研究TEVs的生理功能提供了可能，也為(wei) 癌症的診斷和治療開辟了新的思路：

該方案包括了組織分離、酶消化和離心三步，該方案同樣適用於(yu) 從(cong) 其他類型的實體(ti) 瘤中提取EVs。

申明：執行任何實驗方案都需要遵守當地機構關(guan) 於(yu) 實驗室安全和倫(lun) 理的指導方針。

選對離心方案：差速超速離心！TEVs 的“提純術”

在將腫瘤細胞組織切片、分離和酶消化之後，對於(yu) 關(guan) 鍵分離步驟——離心部分的操作，研究人員用時4小時，通過多步差速離心的方式，依靠TEVs與(yu) 雜質顆粒在大小和密度等不同參數的差異，將其分離出來。

為(wei) 了獲得較高純度的TEVs並盡量提高收率，研究人員在離心操作過程中還分享了一些實用技巧和建議：

第一步離心：Eppendorf 5810R離心機，500 x g，20 min，4 ℃。

此步主要進行組織顆粒及細胞的沉澱分離，保留上清液。

第二步離心：Eppendorf 5810R離心機，3,000 x g，20 min，4 ℃。

此步目的是進一步去除組織碎片，保留上清液。

第三步離心：Sigma 1-14K微型離心機，10,000 x g，30 min，4 ℃。

此步的目的是去除較大細胞微泡（MVs）並富集小的TEVs，保留上清液。

取上清的操作要盡可能地快，以避免細胞沉澱再擴散。
可以在沉澱上方留下少量上清，以避免幹擾上清。
取出的上清液需要用0.22µm孔徑的針頭濾器過濾，此操作中控製擠壓過濾器的力度非常重要，因為(wei) 用力太大可能會(hui) 導致也MVs穿過過濾器。

第四步離心：Hitachi Himac CP80WX超速離心機，P50A3轉頭，110,000 x g， 70 min，4 ℃。

此步是為(wei) 了收集小的TEVs，保留沉澱。

選用新的超速離心管，在裝樣之前，建議先用清水清洗離心管後再用ddH2O充分衝(chong) 洗，因為(wei) 管子內(nei) 部的塗層會(hui) 粘附TEVs並阻礙其沉澱。
可選操作：如果需要進一步純化TEVs顆粒，可以將TEVs顆粒在2.5 mL PBS中重懸，然後將樣品緩慢加到0.5 mL蔗糖/重水墊液層之上，然後110,000 x g， 70 min，4 ℃離心。

第五步離心：Hitachi Himac CP80WX超速離心機，P50A3轉頭，110,000 x g， 70 min，4 ℃。

此步是將前步沉澱在1 mL PBS中重懸後再次離心，將TEVs顆粒進一步純化，保留沉澱。

離心後吸除上清時，建議在TEVs沉澱的對麵進行操作，避免影響TEV沉澱。

圖2：處理TEV沉澱操作（A）離心後，從沉澱對麵小心吸除上清，避免影響TEV沉澱；（B）沉澱附著在離心管側壁。

經過上述操作之後，將最後所得的TEVs沉澱在冰冷的無菌PBS緩衝(chong) 液中重懸，即可作為(wei) 透射電鏡、免疫印跡和納米流式細胞術的測試樣品，可以對其進行進一步的鑒定和研究。

差速離心法分離TEVs是一種高效且高產(chan) 的方法。然而與(yu) 密度梯度離心、尺寸排阻層析、免疫沉澱和超濾等其他分離技術相比，該方法也存在一定的局限性。

差速離心操作相對簡單，但並不適合一些痕量和珍貴樣品的研究。
對於(yu) 組織樣品，使用過濾裝置進行過濾操作是必不可少的，因為(wei) 消化組織的成分包括一些複雜的囊泡幹擾物，比如蛋白聚合物、細胞碎片和微生物。這些物質與(yu) TEVs尺寸相近，如果不進行過濾，將嚴(yan) 重幹擾TEVs後續的鑒定和生物學功能的研究。
過濾操作也會(hui) 影響TEVs的濃度，導致其產(chan) 量下降。

本文所描述的EV分離方案針對乳腺癌（BC）細胞異位移植瘤進行了優(you) 化，並將小鼠三陰BC（4T1）異位移植瘤作為(wei) 實驗模型進行了展示，在操作過程中也分享了一些可以獲得高純度EV和使收率最大化的實用技巧，對於(yu) 其他類型的癌細胞異位移植瘤模型也具有參考價(jia) 值。